Allegato del lavoro dal titolo “Armonizzazione della diagnosi della Flavescenza Dorata della vite (FD): risultati della prova comparativa“ in corso di stampa su Informatore Agrario n. anno 2001
Tabella 3 – Protocollo 1 di diagnosi per Flavescenza Dorata.
A= Metodo di estrazione del DNA totale dal materiale vegetale.
B= Esecuzione del saggio molecolare.
|
PROTOCOLLO
1 |
|
|
A - METODO DI ESTRAZIONE del DNA TOTALE (Barba et al.,
1998) 1. Lavare accuratamente le foglie. Preparare 1,5 gr di nervature centrali da foglie senza necrosi evidenti. Cambiare lama e supporto di taglio per ogni campione. Utilizzando un bisturi, tagliare le nervature e raccoglierle in piccoli pezzi in un mortaio precedentemente raffreddato e mantenuto in ghiaccio, aggiungendo 7-8 ml di PGB (Phytoplasma Grinding Buffer) freddo e preparato poco prima dell’uso. Incubare in ghiaccio per 10-15 min. 2. Aggiungere 50 mg di sabbia di quarzo sterile e sminuzzare accuratamente col pestello. Aggiungere ancora 5 ml di tampone freddo nel mortaio e continuare la macerazione fino ad ottenere una miscela omogenea. 3. Trasferire la miscela in una provetta tipo Corex da 15 ml e centrifugare (il rotore deve essere stato preventivamente raffreddato) a 2.500g per 5 min in centrifuga refrigerata a 4°C: Quindi trasferire con cautela il supernatante in una provetta Corex da 15 ml pulita e pre-raffreddata in ghiaccio. 4. Centrifugare a 4°C a 18.000g per 20 min. Scartare con attenzione il supernatante e far asciugare le provette capovolte per 1-2 min. 5. Risospendere bene (senza fare schiuma) il pellet in 3 ml di CTAB buffer usando pipette Pasteur monouso con bocca larga. Trasferire 1 ml in una provetta Eppendorf da 2 ml. Incubare in bagno termostatato (60°C) per 60 min. Agitare le provette un paio di volte durante il periodo di incubazione. 6. Aggiungere 1 ml di cloroformio-alcol isoamilico (24:1), mescolare la soluzione energicamente e passarla al vortex per omogeneizzarla. Centrifugare 6.000 rpm per 10 min, a temperatura ambiente, poi prelevare con attenzione la fase acquosa superiore e trasferirla in una nuova provetta Eppendorf. 7. Precipitare gli acidi nucleici aggiungendo un volume di isopropanolo freddo, mescolando. Mettere i tubi a 4°C o in ghiaccio per 30 min. Centrifugare 13.000 rpm per 10 min. Quindi scartare il supernatante alcolico e lavare attentamente la provetta con etanolo 70%. Lasciare asciugare all’aria per circa 5 min. 8. Risospendere gli acidi nucleici nel tubo con 400 ml di TE. Precipitarli aggiungendo 40 ml di 3M sodio acetato pH 5,2 e 0,9 ml di etanolo 95%. Lasciare incubare per almeno 3 ore a –20°C o 30 min a –80°C. Centrifugare a 13.000 rpm per 15 min, quindi scartare il supernatante alcolico e lavare la provetta con etanolo 70%. Lasciare asciugare all’aria per circa 5 min, o meglio, fino a che il preparato è inodore. 9. Risospendere il DNA in 100 ml di acqua distillata sterile. N.B.= Gli acidi nucleici così estratti e sciolti in acqua sterile possono essere mantenuti a –20°C per un periodo di circa 6 mesi. Importante è evitare ripetuti scongelamenti. TAMPONI UTILIZZATI per
l’ESTRAZIONE degli ACIDI NUCLEICI PGB (Phytoplasma Grinding Buffer) per 1 litro 2% CTAB buffer per 500 ml K2HPO4 16,7g (anidro) o 21,7 g (idrato) CTAB 10 gr KH2PO4 4,1 g
Tris pH 8,0 25 ml da 2M Saccarosio 100 g NaCl 40 ml da 5M BSA 1,5 g
EDTA 20 ml da 0,5M
pH 8,0 PVP
P.M.10.000 20 g Acido ascorbico
5,3 g TE
buffer PH 7,6 con KOH
10 mM Tris-HCl pH 8,0 Preparare poco prima dell’uso
1 mM EDTA pH 8,0 NON AUTOCLAVARE |
|
|
B -ESECUZIONE DEL SAGGIO MOLECOLARE PCR DIRETTA Si utilizzano i primers
universali P1/P7 (Deng and Hiruki,
1991; Schneider et al., 1995), le
cui sequenze sono: P1: 5’-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T-3’ P7: 5’-CGT CCT TCA TCG
GCT CTT-3’ Mix: 10X buffer 5 ml 25 mM MgCl2 4 ml 2,5 mM dNTPs 5 ml 5 mM R16F2 4 ml 5 mM R16R2 4 ml 5 U/ml Taq 0,2 ml H2O 25,8 ml Dispensare 48 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2 ml di acido nucleico estratto, mescolando bene.
Lo schema prevede 35 cicli così caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min primo ciclo) 1 min 30 sec, 55°C 1 min 20 sec, 72°C (5 min ultimo
ciclo) PCR NESTED Si utilizzano i
primers R16(V)F1/R1 (Lee I.M. et
al., 1994) le cui sequenze sono: R16(V)F1: 5’-TTA
AAA GAC CTT CTT CGG-3’ R16(V)R1: 5’-TTC AAT CCG TAC TGA GAC TAC
C-3’ Mix: 10X buffer 5 ml 25 mM MgCl2 4 ml 2,5 mM dNTPs 5 ml 5 mM R16(V)F1 4 ml 5 mM R16(V)R1 4 ml 5 U/ml Taq 0,2 ml H2O 25,8 ml Dispensare 48 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2 ml di amplicone della PCR diretta, diluito 1:40, mescolando bene. Lo schema prevede 35 cicli così caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min primo ciclo) 1 min, 50°C 1 min 15sec, 72°C (5 min ultimo ciclo) Visualizzare la banda in gel di agarosio all’1,2%,
dopo colorazione in etidio bromuro. |
|
Tabella 4 – Protocollo 2 di diagnosi per Flavescenza Dorata.
A= Metodo di estrazione del DNA totale dal materiale vegetale.
B= Esecuzione del saggio molecolare.
|
PROTOCOLLO 2 |
|
A - METODO DI ESTRAZIONE
del DNA TOTALE (Prince et al., 1993), Sciacquare accuratamente le
foglie in acqua corrente ed asciugarle. 1. Preparare circa 1,5 gr. di
nervature centrali da foglie verdi fresche, senza necrosi evidenti.
Utilizzando un bisturi, tagliare le nervature e raccoglierle in piccoli pezzi
in un mortaio precedentemente raffreddato e mantenuto in ghiaccio, le
nervature vengono polverizzate in azoto liquido con un pestello, anch’esso
sterilizzato. Triturare successivamente aggiungendo 8 ml di PGB (Phytoplasma
Grinding buffer) freddo e preparato poco prima dell’uso. 2. Trasferire la miscela in una
provetta tipo corex da 15 ml e centrifugare (il rotore deve essere stata
preventivamente raffreddato) per 20
minuti a 13.000 rpm a 4°C. Risospendere il pellet in 4 ml di Extraction buffer,
a cui vengono aggiunti: 80 ml di una soluzione acquosa di Proteinase K
(0,1 mg/ml) e 440 ml di Sarkosil al 10%. 3. Incubare la miscela ottenuta per 1 ora a 55°C. 4. Centrifugare per 10 min a 8.000 rpm,
scartare il supernatante ed aggiungere al pellet gelatinoso 2,5 ml di
isopropanolo per ottenere la precipitazione dell’acido nucleico grezzo. E’
necessario mescolare gentilmente il campione perché avvenga la
precipitazione. 5. Incubare a -20°C per 30 minuti oppure tutta la notte a
4°C. 6. Centrifugare per 15 minuti a
8.000 rpm, eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 3 ml di
tampone TE, contenente 100 mg/ml di Proteinase K e SDS 0,5%. 7. Incubare in bagnomaria a 37°C per 1 ora. 8. Aggiungere 525 ml di NaCl 5 M e 420 ml di CTAB in 0,7 M NaCl ed
incubare per 10 minuti a 65°C. 9. Aggiungere 2 ml di fenolo
saturato con tampone TE e 2 ml di una miscela composta da cloroformio/alcol
isoamilico in rapporto 25:24:1, vortexare gentilmente e centrifugare a 4°C
8.000 rpm per 10 minuti. 10. Prelevare il supernatante ed
aggiungere 4 ml di cloroformio/alcol isoamilico, centrifugare per 10 minuti a
8.000 rpm e trasferire il supernatante. 11. Aggiungere 2,5 ml di isopropanolo ed incubare tutta la
notte a 4°C. 12. Centrifugare a 11.000 rpm per 30 minuti. 13. Lavare il pellet con 1 ml di
etanolo 70% a freddo (facendo
attenzione a non staccare il pellet dalla parete della provetta) e centrifugare a 11.000 rpm per 10 minuti.
Lasciare asciugare il pellet all’aria finchè diviene inodore (2-4 ore). 14. Risospendere il pellet in TE, mescolando dolcemente fino al suo completo scioglimento.
Mantenere in ambiente refrigerato a 4°C. Quantificare la
concentrazione dell’acido nucleico allo spettrofotometro. N.B.= Gli acidi
nucleici così estratti e sciolti in acqua sterile possono essere
mantenuti a –20°C per
un periodo di circa 6 mesi. Importante è evitare ripetuti
scongelamenti.
TAMPONI UTILIZZATI per
l'ESTRAZIONE degli ACIDI NUCLEICI PGB (Phytoplasma Grinding buffer) per 1 litro K2HPO4 16,7
g (anidro) o 21,7 g (idrato) KH2PO4 4,1 g Saccarosio
100 g Siero albumina bovina
(frazione V) 1,5 g Polivinilpirrolidone (PVP) P.M. 10.000 20 g Acido ascorbico 5,3 g Portare a pH 7,6 con KOH e mantenere
in ghiaccio Preparare poco prima
dell’uso previa filtrazione con filtri 0,2m Extraction buffer per 1 litro TRIS HCl 100 mM pH 8 100 ml NaCl 14,5
g (concentrazione finale: 250 mM) EDTA 37,2
g (concentrazione finale: 100 mM) Autoclavare 10% CTAB Buffer per 1 litro CTAB 10
g NaCl 41
g Sciogliere 41 g di NaCl in
800 ml di H2O, aggiungere lentamente il CTAB scaldando e agitando.
Portare a volume. NaCl 5M per 1 litro TE
buffer pH 8,0 NaCl 290 g
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM EDTA pH 8,0 B - ESECUZIONE DEL SAGGIO MOLECOLARE 1-
PCR DIRETTA Si utilizzano i primers
universali P1/P7 (Deng and Hiruki,
1991; Schneider et al., 1995), le
cui sequenze sono: P1: 5’-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T-3’ P7: 5’-CGT CCT TCA TCG GCT CTT-3’ Mix: 10X
PCR buffer 5 ml 2,5
mM dNTPs 4 ml primer
P1 20mM 1 ml primer
P2 20mM 1 ml Amplitaq 5U/ml 0,32 ml H2O 33,68 ml DNA template 20 mg/ml 0,8 ml ________________________________________ TOTALE 50 ml Dispensare 49,2 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 0,8 ml di acido nucleico estratto, mescolando bene. Lo schema previsto prevede 35 cicli così
caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min
per il primo ciclo) 2 min, 50°C 3 min, 72°C (10 min
per l’ultimo ciclo) 2- PCR NESTED I Si utilizzano i
primers R16F2/R2 (Lee I.M et al.,
1993) le cui sequenze sono: R16F2: 5’-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3’ R16R2: 5’-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3’ 10X
PCR buffer 5 ml 2,5
mM dNTPs 4 ml primer
R16F2 20mM 1 ml primer
R16R2 20mM 1 ml Amplitaq
5U/ml 0,32 ml amplicone P1/P7 dil. 1:30 2 ml H2O a volume ________________________________________ TOTALE
50 ml Dispensare 48 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2
ml di amplicone della PCR diretta, diluito
1:40, mescolando bene. Lo schema previsto prevede 35 cicli così
caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min
per il primo ciclo) 2 min, 50°C 3 min, 72°C (10 min
per l’ultimo ciclo) 2- PCR NESTED II Si utilizzano i
primers R16(V)F1/R1 (Lee I.M. et
al., 1994) le cui sequenze sono: R16(V)F1: 5’-TTA
AAA GAC CTT CTT CGG-3’ R16(V)R1: 5’-TTC
AAT CCG TAC TGA GAC TAC C-3’ 10X
PCR buffer 5 ml 2,5
mM dNTPs 4 ml primer
R16(V)F1 20mM 1 ml primer
R16(V)R1 20mM 1 ml Amplitaq
5U/ml 0,32 ml amplicone R2/F2 dil. 1:30 2 ml H2O a volume _______________________________________ TOTALE
50 ml Dispensare 48 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2 ml di amplicone della PCR NESTED I, diluito 1:40, mescolando bene. Lo schema previsto prevede 35 cicli così
caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min
per il primo ciclo) 2 min, 50°C 3 min, 72°C (10 min
per l’ultimo ciclo) Si visualizza in gel e la
lunghezza del prodotto è 1100 circa
nucleotidi. |
Tabella 5 – Protocollo 3 di diagnosi per Flavescenza Dorata.
A= Metodo di estrazione del DNA totale dal materiale vegetale.
B= Esecuzione del saggio molecolare.
|
PROTOCOLLO 3 |
|
A -METODO DI ESTRAZIONE del
DNA TOTALE (Daire et
al., 1997), 1.
Sciacquare
accuratamente le foglie in acqua corrente ed asciugarle; 2.
Cambiare
lama e supporto di taglio ad ogni campione. Preparare circa 1 g circa di
nervature centrali da
foglie fresche, senza necrosi evidenti e metterle in sacchetti “tipo ELISA”; 3.
aggiungere
7 ml per grammo di campione di tampone CTAB 3%, (aggiungere
l’antiossidante all’ultimo momento:
DTT 0,4% o 2-mercaptoetanolo 0,2% e riscaldare il tampone a 65°C); 4.
omogeneizzare
i campioni e trasferire (con punte di micropipette tagliate) 1ml in eppendorf
da 2 ml; 5.
mettere
ad incubare a 65°C per 20’. Agitare le provette almeno una volta durante
l’incubazione; 6.
aggiungere
1 ml di cloroformio, mescolare bene; 7.
centrifugare
a 11.000g per 10’ a temperatura
ambiente; 8.
trasferire
il surnatante in una nuova eppendorf da 2 ml, aggiungere 1 ml di isopropanolo
freddo, mescolare bene; 9.
centrifugare
11.000g per 15’ a 4°C; 10.
eliminare
il surnatante (facendo attenzione al pellet), rovesciare i tubi per scolare
meglio; 11.
lavare
il pellet con 1 ml di etanolo 70% freddo (versare 1 ml di etanolo nella
eppendorf ed eliminarlo dopo pochi
minuti rovesciando il tubo); 12.
lasciare
asciugare bene il pellet: tenere le provette capovolte e poi lasciarle
asciugare all’aria fino a che il pellet diviene inodore;
N.B.= Gli acidi nucleici così estratti e sciolti in
acqua sterile possono essere mantenuti
a –20°C per un periodo di circa 6 mesi. Importante è
evitare ripetuti scongelamenti. TAMPONE DI ESTRAZIONE CTAB 3% pH 8,0 CTAB gr 30 3% Tris gr
121,1 1M NaCl gr
81,816 1,4M EDTA 0,5M ml 40 20mM Acqua sterile fino
ad 1 litro portare a pH con HCl puro |
|
B -ESECUZIONE DEL SAGGIO MOLECOLARE 1- PCR DIRETTA
Si utilizzano i primers
universali P1/P7 (Deng and Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), le cui sequenze sono: P1: 5’-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T-3’ P7: 5’-CGT CCT TCA TCG GCT CTT-3’ o, in alternativa, i
primers universali R16F2/R2 (Lee et al.,1993), le cui sequenze sono: R16F2: 5’-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3’ R16R2: 5’-TGA
CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G-3’ Mix: per 1 campione H2O 27,68ml 10X PCR buffer * 5 ml 25 mM MgCl2*
3 ml 2,5 mM dNTPs ciascuno 4 ml 5 mM P1 o R16F2 4 ml 5 mM P7 o R16R2 4 ml 5 U/ml Taq 0,32 ml 1U/tubo ________________________________________ TOTALE 48 ml * fornito sempre insieme alla Taq Dispensare 48 ml della miscela di reazione in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2 ml di acido nucleico estratto,
diluito 1:10 mescolando bene. Lo schema previsto prevede
35 cicli così caratterizzati: 1 min, 94°C (3 min
per il primo ciclo) 2 min, 50°C 3 min, 72°C (5 min
per l’ultimo ciclo) 2- PCR NESTED Si utilizzano i primers R16(V)F1/R1 (Lee I.M et al. 1995) le cui sequenze sono: R16(V)F1: 5’-TTA
AAA GAC CTT CTT CGG-3’ R16(V)R1: 5’-TTC AAT CCG TAC TGA GAC TAC C-3’ Mix: per
1 campione H2O 27,68ml 10X PCR buffer * 5 ml 25 mM MgCl2* 3 ml 2,5 mM dNTPs ciascuno 4 ml 5 mM R16(V)F1 4 ml 5 mM R16(V)R1 4 ml 5 U/ml Taq 0,32 ml 1 U/tubo ________________________________________ TOTALE 48 ml * fornito sempre insieme alla Taq Dispensare 48 ml della miscela di reazione
in ogni tubo di reazione. Aggiungere 2 ml di amplicone della PCR diretta, diluito 1:40, mescolando bene. Lo schema previsto prevede
35 cicli così caratterizzati: 1 min, 94°C
(3 min per il primo ciclo) 2 min, 50°C 3 min, 72°C (5 min
per l’ultimo ciclo) Visualizzare la banda in gel di agarosio all’1,2%, dopo colorazione in etidio bromuro. |