Riassunti/Summary
Sessione I
Classificazione, caratterizzazione e diagnosi
Coordinatori: Nazia Loi e Piero Attilio Bianco
Analisi della variabilità genomica di fitoplasmi tramite AFLP
Sabrina Palmano1 e Giuseppe Firrao2
1Istituto di Virologia Vegetale, CNR, Strada delle Cacce 73, 10135 Torino
2Dipartimento di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante , Università di Udine
La tecnica AFLP (amplified fragment length polymorphism) è stata utilizzata quale mezzo di analisi delle variazioni genomiche dei fitoplasmi. Data la differenza in contenuto molare percentuale delle basi azotate C e G tra il DNA della pianta e quello del fitoplasma, il DNA totale estratto è stato digerito con enzimi i cui siti di restrizione sono formati esclusivamente dalle basi A e T. E’ stata poi condotta un’amplificazione selettiva di alcuni dei frammenti di restrizione, utilizzando primers recanti un’estensione di ulteriori A o T rispetto ai siti di restrizione.
In relazione alla lunghezza di questa estensione, sono stati visualizzati tramite gel elettroforesi profili di diversa complessità. L’utilizzo di primers privi di estensione hanno prodotto patterns di 30 o più basi, a seconda del metodo di visualizzazione usato (bromuro d’etidio; colorazione d’argento; fluorescenza); anche dal DNA proveniente da campioni sani è stata ottenuta l’amplificazione di un discreto numero di bande. Viceversa, con primers recanti un’estensione di tre basi, ogni campione è stato in grado di produrre un profilo di 4 – 10 bande, mentre non è stata rilevata alcuna banda in campioni sani.
L’analisi dei frammenti amplificati ha permesso una buona discriminazione tra fitoplasmi appartenenti a gruppi diversi (Apple proliferation, Western X disease, Stolbur). Un’eccellente discriminazione si è ottenuta anche tra fitoplasmi appartenenti ad uno stesso gruppo, persino tra ceppi con una sequenza del 16S rDNA identica al 100%.
Parole chiave: fitoplasmi, variabilità genomica, AFLP.
Summary
Analysis of genomic diversity of phytoplasmas using AFLP
The AFLP (amplified fragment length polymorphism) fingerprinting technique has been used as a tool to analyse genomic variations/diversity between phytoplasmas. Given the different GC% molar content between the plant and the phytoplasma DNA, the total DNA has been digested using enzymes with restriction site composed only of A or T nucleotides. After ligation with oligonucleotide adapters, selective amplification of sets of restriction fragment has been performed by the use of primers that extend into the restriction site in up to 3 A or T bases.
Depending on the length of the extension, patterns of different complexity could be visualized by gel analysis.
The use of primers with no base extension produced patterns with 30 or more bands, depending on the gel visualization method used (ethidium bromide, silver staining, fluorescence); amplification occurred also from the healthy sample DNA, although the number of bands produced was lower. Conversely, using primers with extension of 3 bases, each sample produced 4 -10 bands (depending on both the strain and the enzyme used), while no bands were detected in the healthy control.
The analysis of the amplified fragment allowed a good discrimination between phytoplasmas belonging to different groups (Apple proliferation, Western X disease, Stolbur phytoplasmas). Excellent differentiation could also be obtained within groups, even between strains 100% identical 16S rDNA sequence.
Key words: phytoplasmas, genomic diversity, AFLP.
Classificazione molecolare dei fitoplasmi del gruppo “elm yellows” (16SrV) basata sui geni del 16S rRNA e delle proteine ribosomiali
ING-MING LEE1, MARTA MARTINI1, 2, CARMINE MARCONE3
1USDA-ARS Molecular Plant Pathology Laboratory, Beltsville, MD 20705, USA;
2Dipartimento di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante,
Universitá di Udine, 33100 Udine (UD).
3Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali,
Universitá della Basilicata, 85100 Potenza (PT).
I fitoplasmi del gruppo (16SrV) “elm yellows” (EY) sono stati precedentemente classificati sulla base dell’analisi RFLP delle sequenze del gene 16S rRNA. L’analisi filogenetica, usando le sequenze del 16S rRNA, ha rivelato che essi formano un gruppo filogenetico distinto (“subclade”) all’interno del “clade” dei fitoplasmi. Il gruppo EY rappresenta ora il terzo gruppo di fitoplasmi piu` vario, accanto a quello di “aster yellows” (gruppo 16SrI) e di “X-disease” (gruppo 16SrIII) (Lee et al., 1998). Il ceppo americano EY1 di “elm yellows” è considerato come “tipo” del gruppo. I ceppi del fitoplasma EY causano deperimento degli olmi d’America e di olmi e ibridi euroasiatici. Altri fitoplasmi del gruppo EY sono associati a malattie devastanti per la vite (“flavescence dorée”, FD), il rovo (“rubus stunt”, RuS), l’ontano (“alder yellows, ALY), il giuggiolo (“jujube witches’-broom”, JWB), il ciliegio (“cherry lethal yellows”, CLY), il pesco (“peach yellows”, PY) e altre specie di piante in America, Europa ed Asia. Per studi epidemiologici e per scopi di quarantena è importante poter disporre di un sistema di classificazione che permetta una differenziazione rapida e attendibile tra questi diversi ceppi di fitoplasmi. Lo scopo del presente studio è stato quello di studiare le interrelazioni filogenetiche tra i membri del gruppo EY basandosi sull’analisi combinata delle sequenze del 16S rRNA e delle proteine ribosomiali (rp), e di sviluppare e valutare un nuovo strumento per una piu` fine differenziazione dei ceppi. Attraverso l’analisi RFLP del 16S rRNA sono stati individuati 5 sottogruppi, mentre attraverso l’analisi RFLP delle proteine ribosomiali ne sono stati individuati 12. Sulla base delle analisi filogenetiche dei geni delle proteine ribosomiali, soli o combinati con quelli del 16S rRNA, sono state delineate 12 diverse linee evolutive corrispondenti ai sottogruppi rp definiti attraverso i profili di RFLP. La distinzione in sottogruppi basata sulle sequenze delle proteine ribosomiali è apparsa riflettere le specifiche nicchie ecologiche (pianta ospite, insetto vettore o regioni geografiche) dei fitoplasmi nel gruppo EY. Questo tipo di approccio costituisce pertanto un sistema di classificazione particolarmente valido.
Parole chiave: fitoplasma, gruppo di “elm yellows”, geni delle proteine ribosomiali, RFLP.
Summary
Molecular classification of elm yellows group (16SrV) phytoplasmas based on 16S rRNA and ribosomal protein genes.
Elm yellows (EY) group (16SrV) phytoplasmas were previously categorized based on RFLP analysis of 16S rRNA gene sequences. Phylogenetic analysis using 16S rDNA sequences revealed that they form a discrete phylogenetic group (subclade) within the phytoplasma clade. The EY group now represents the third most diverse phytoplasma cluster, next to aster yellows (group 16SrI) and X-disease (group 16SrIII) phytoplasma groups (Lee et al., 1998). The American elm yellows phytoplasma strain EY1 is the type strain representing the group. The EY phytoplasma strains cause decline of American elms and Eurasian elm species and hybrids. Other EY group phytoplasmas are associated with devastating diseases in grapevine (flavescence dorée, FD), blackberry (rubus stunt, RuS), alder (alder yellows, ALY), jujube (jujube witches’-broom, JWB), cherry (cherry lethal yellows, CLY), peach (peach yellows, PY) and other plant species in America, Europe and Asia. For epidemiological studies and for quarantine purposes, it is important to have a classification system that allows for rapid and reliable differentiation among these diverse phytoplasma strains. The aim of the present study was to investigate phylogenetic interrelationships among members of the expanded EY phytoplasma group based on combined analyses of 16S rRNA and ribosomal protein (rp) gene sequences, and to develop and evaluate a new means for finer strain differentiation. Five subgroups were identified by RFLP analysis of 16S rRNA gene, while 12 subgroups were resolved by analysis of rp genes. Based on phylogenetic analyses of rp genes or 16SrRNA and rp genes combined, 12 different lineages were resolved consistent with rp subgroups defined by RFLP patterns. Subgroup differentiation based on rp gene sequences appeared to reflect the specific ecological niches (host plant, vector, or geographical regions) of phytoplasmas in the EY group. Thus this approach represents a more efficient classification system.
Key words: phytoplasma, elm yellows group, ribosomal protein genes, RFLP.
Lavori citati
LEE I.-M., D.E. GUNDERSEN-RINDAL, R.E. DAVIS, I.M. BARTOSZYK, 1998. Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences.
Localizzazione di H2O2 in piante di melo infettate con fitoplasmi
RITA MUSETTI1, LUIGI SANITÀ DI TOPPI2, PAOLO ERMACORA1,
MARIA AUGUSTA FAVALI2
1Dipartimento di Biologia Applicata alla Difesa delle Piante, Università di Udine, via delle Scienze, 208, I- 33100 Udine
2Dipartimento di Biologia Evolutiva e Funzionale, Università di Parma, Parco Area delle Scienze, 11/A, I- 43100 Parma
Le cellule delle piante producono ossigeno attivo (ROS = reactive oxygen species) durante l’interazione con gli organismi patogeni. Il termine ROS descrive radicali o molecole reattive derivate dall’ossigeno, tra i quali l’anione superossido (O2-) e l’idrogeno perossido (H2O2): tali molecole sono difficili da monitorare nelle piante perché chimicamente instabili e soggette all’azione di meccanismi antiossidanti regolati da enzimi come superossido dismutasi, perossidasi, catalasi e da metaboliti quali ascorbato/glutatione. Si è ipotizzato che l’ossigeno attivo, prodotto in risposta a patogeni ed elicitori, abbia effetti antibiotici e antimicrobici e che abbia un ruolo importante in meccanismi di difesa, quali produzione di lignina, perossidazione di lipidi, produzione di fitoalessine e reazione di ipersensibilità (Baker and Orlandi, 1995).
Scopo del nostro lavoro è stato studiare, mediante marcatura con CeCl3 e osservazione al microscopio elettronico a trasmissione, la localizzazione di idrogeno perossido (H2O2) in piante di melo (tre diverse cultivars), prendendo in considerazione piante infettate con Apple Proliferation (AP), piante sane e piante in “recovery”. I meli in “recovery” avevano manifestato remissione dei sintomi nella chioma associata alla scomparsa dei Fitoplasmi, che però permanevano nelle radici (Osler et al., 1999). Inoltre, sono stati saggiati, su tutte le piante, proteine totali, attività perossidasica, contenuto di glutatione e malondialdeide, quest’ ultima molecola prodotta a seguito di perossidazione lipidica. Le osservazioni ultrastrutturali hanno evidenziato una precisa marcatura a livello del floema solo nelle piante in recovery e solo nei tessuti fogliari. Il confronto tra attività perossidasica e contenuto di glutatione e di malondialdeide in piante sane, malate e in “recovery” ha rivelato differenze significative tra le diverse tipologie di piante. I dati saranno discussi nel tentativo di far maggior luce sul fenomeno del “recovery”.
Parole chiave: H2O2, melo, AP fitoplasma, recovery, microscopia elettronica, perossidasi, glutatione, malondialdeide.
H2O2 localization in apple trees infected with phytoplasmas
The localization of H2O2 in apple plants, healthy, AP-infected and recovered is here discussed. Peroxidase activity valuation, glutathione and malondialdehyde content were also carried out as attempt to better know the “recovery” phenomena.
Key words: H2O2, apple, AP phytoplasma, recovery, electron microscopy, peroxidase, glutathione, malondialdehyde.
BAKER C.J., E.W. ORLANDI, 1995. Active oxygen in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 33, 299-321.OSLER R., N. LOI, L. CARRARO, P. ERMACORA, E. REFATTI, 1999. Recovery in plants affected by phytoplasmas. Proc. 5th Congress of European Foundation for Plant Pathology, 589-592.